用于检测转基因玉米品系MIR604的常温扩增用LAMP核酸引物,上述LAMP扩增用核酸引物包含FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物、LF引物和LB引物,本发明的LAMP检测体系具有良好的特异性、灵敏度,能快速、方便、高效的检测转基因玉米品系MIR604,满足口岸及基层实验室对转基因玉米品系MIR604检测的需要。
1.一种用于转基因玉米品系MIR604检测的LAMP引物组,其特征在于,序列为:F3:5’-ACGCCAGATCACACATGGA-3’B3:5’-GCCAATTCCTGCAGCGTT-3’FIP:5’-AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCTTTTGGCAGCTAGCCGAGCA-3’BIP:5’-AGGGAGTCACGTTATGACCCCCTTTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAA-3’LF:5’-GCGTGCGCAGAGCGCC-3’LB:5’-GCCGATGACGCGGGACAA-3’。
2.一种用于转基因玉米品系MIR604检测的常温扩增方法,其特征在于,用权利要求1中的LAMP引物组对待测样品进行DNA扩增,扩增条件63°C1小时,如果电泳结果产生特异梯状谱带,则该样品含有转基因玉米品系MIR604,如果结果没有出现特异梯状谱带,则样品中不含有转基因玉米品系MIR604。技术领域
本发明涉转基因玉米品系检测领域,提供了利用常温扩增技术对转基因玉米品系MIR604的检测,适用于口岸检验检疫机构应用。
背景技术
伴随着转基因技术的迅猛发展,全球农业生物技术的产业化速度也随之大大加快,转基因作物的推广种植面积逐年递增,然而,由于目前对转基因产品的安全性尚无定论,各国政府和消费者普遍对此采取谨慎的态度,纷纷出台一系列法规对转基因产品的贸易加以限制,要求对转基因作物及其加工产品进行标识。因此,建立完善的转基因农产品及食品检测体系显得尤其重要。转基因涉及的作物种类繁多,包括大豆、玉米、小麦、棉花、番茄、马铃薯等,而每个转基因品系在转基因和育种过程中采取的策略不同,造成每个品系都有独特的基因组插入位置及边界序列,目前我国对转基因玉米品系采取审批制度,未经允许的玉米品系禁止进入我国,而目前对具体玉米品系的检测的检测方法还在研究过程中,因此需要设计特异的品系检测方法,满足进出境转基因产品品系鉴定的需求。由于普通PCR方法、实时荧光PCR检测方法需要变温过程及其相应的快速升降温及温度控制,也就需要价格高昂的专用PCR设备,昂贵的仪器设备以及严重的污染问题(假阳性率高),限制了PCR检测方法的推广。而现场检测要求降低对仪器的依赖,等温扩增方法可以解决目前转基因生物安全检测对仪器依赖程度高的缺陷和不足,满足现场检测需要。本发明应用LAMP引物恒温扩增技术运用于转基因玉米品系MIR604的快速检测,可以免除高昂的仪器投入,便于基层及现场检测使用,同时对其他转基因品系的快速检测也具有很重要的借鉴意义。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供用于检测转基因玉米品系MIR604的LAMP引物组。本发明用于检测转基因玉米品系MIR604的LAMP引物序列为:F35’-ACGCCAGATCACACATGGA-3’B35’-GCCAATTCCTGCAGCGTT-3’FIPxa05’-AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCTTTTGGCAGCTAGCCGAGCA-3’BIPxa0xa05’-AGGGAGTCACGTTATGACCCCCTTTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAA-3’LFxa05’-GCGTGCGCAGAGCGCC-3’LBxa05’-GCCGATGACGCGGGACAA-3’用上述引物组队待测样品DNA进行恒温扩展,若结果产生梯状DNA条带,则该样品含有转基因玉米品系MIR604,若扩增结果没有出现条带,则该样品中不含有转基因玉米品系MIR604。与现有技术相比,本发明的进步在于:检测仪器简单,无需昂贵的PCR仪投入,只需简单的水浴锅即可,降低了实验室投入,适合基层实验室推广使用。
附图说明
附图1.LAMP引物组恒温扩增结果。泳道为转基因玉米品系MIR604,均能扩增出梯状DNA条带,泳道为对照,而未出现条带。M为DL2000Marker,5泳道为MIR604,11泳道为阴性对照,1.其余泳道为其他玉米转基因品系
具体实施方式
LAMP引物设计:1xa0xa0xa0xa0AAGAGAAGAAxa0AAATTCGTCCxa0ATGGGGCCACxa0GGCCTCTTCTxa0GCAGGCATTTxa0GGCATGTGAA61xa0xa0xa0GGAACCCGAAxa0CCAGTGAATGxa0GAGATGGACGxa0GATGCTGCTCxa0AGATACGCAGxa0TCAAACCTGC121xa0xa0CGGCGAAATTxa0ACGGGGGGAGxa0CTGGCTGGCTxa0GGCTGGCTGGxa0ACGCCAGATCxa0ACACATGGATxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0F3181xa0xa0GACGCGGCACxa0GGCAGCTAGCxa0CGAGCAntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="474"/>AATTCAACxa0AGAAGGCGGGxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0F2xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0LF241xa0xa0AAACGACAATxa0CTGATCATGAxa0GCGGAGAATTxa0AAGGGAGTCAxa0CGTTATGACCxa0CCCntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="191"/>xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0F1Cxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0B1C301ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="318"/>GCCGTTTTAxa0CGTTTGGAACxa0TGACAGAACCxa0GCAACGCTGCxa0AGGAATTGGCxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0LBxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0B2xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0B3361xa0xa0CGCAGCGGCCxa0ATTTAAATCAxa0ATTGGGCGCGxa0CCGAATTCGAxa0GCTCGGTACAxa0AGCTTGCACA421xa0xa0TGACAACAATxa0TGTAAGAGGAxa0TGGAGACCACxa0AACGATCCAAxa0CAATACTTCTxa0GCGACGGGCTF3:ACGCCAGATCACACATGGAB3:GCCAATTCCTGCAGCGTTFIP=F1C+F2:AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCTTTTGGCAGCTAGCCGAGCABIP=B1C+B2:AGGGAGTCACGTTATGACCCCCTTTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAALF:GCGTGCGCAGAGCGCCLB:GCCGATGACGCGGGACAA试剂和设备水浴锅,引物由上海英俊生物技术有限公司合成,Bstxa0DNA聚合酶购自NEB,甜菜碱(Betaine)、DNTPmix购自Sigma,,标本来源本发明说采用的玉米品系样品59122、GA21、3272、MON863、MIR604、NK603、TC1507、BT11、DBT418、MON810等购自SIGMA,编码xa0xa0xa0xa0xa0玉米品系1xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0591222xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0GA213xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa032724xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0MON8635xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0MIR6046xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0NK6037xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0TC15078xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0BT119xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0DBT41810xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0MON810实施例1、转基因玉米品系MIR604LAMP引物检测方法DNA提取:50mg左右玉米粉末,用Qiagenxa0Dneasyxa0Plantxa0Minixa0Kit试剂盒提取DNA。反应体系:每反应的混合液总体积为25μl10*ThermoPolxa0Bufferxa02.5μl10mMxa0DNTPmixxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01μl5Mxa0Betainexa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa05μl10μMxa0FIPxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa02μl10μMxa0BIPxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa02μl10μMxa0F3vxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa00.5μl10μMxa0B3xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa00.5μl10μMxa0LFxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01μl10μMxa0LBxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01μl8U/lxa0Bst酶xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01μlDDxa0H₂Oxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa08μl模板DNAxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa00.5μlxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa025μl反应程序:63°C水浴锅反应1h。结果:5泳道样品为转基因玉米品系MIR604,扩增出现梯状特异性条带,结果表明本发明引物对的特异性强,对其它转基因玉米品系59122、GA21、3272、MON863、MON810、NK603、TC1507、BT11、DBT418等等玉米品系没有非特异性条带出现。序列表<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1ACGCCAGATCACACATGGAxa019<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GCCAATTCCTGCAGCGTTxa018<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>3AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCTTTTGGCAGCTAGCCGAGCAxa041<210>1<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>4AGGGAGTCACGTTATGACCCCCTTTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAAxa045<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>5GCGTGCGCAGAGCGCCxa016<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6GCCGATGACGCGGGACAAxa018